【2015版中国药典-中药篇】 牛膝分析

■《中国药典》 收载情况

【来源】 本品为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl. 的干燥根。冬季茎叶枯萎时采挖,除去须根和泥沙,捆成小把,晒至干皱后,将顶端切齐,晒干。
【功能与主治】 逐瘀通经,补肝肾,强筋骨,利尿通淋,引血下行。用于经闭,痛经,腰膝酸痛,筋骨无力,淋证,水肿,头痛,眩晕,牙痛,口疮,吐血,衄血。
【含量测定】 β-蜕皮甾酮照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水-甲酸(16 : 84 : 0.1)为流动相;检测波长为250nm。理论板数按β-蜕皮甾酮峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备:取β-蜕皮甾酮对照品适量,精密称定,加甲醇制成每l mL含0.1mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备:取本品粉末(过三号筛)约lg,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水饱和正丁醇30mL,密塞,浸泡过夜,超声处理(功率300W,频率40kHz)30分钟,滤过,用甲醇10mL分数次洗涤容器及残渣,合并滤液和洗液,蒸干,残渣加甲醇使溶解,转移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即得。

■牛膝药材高效液相色谱方法的建立

【色谱行为描述】
  《中国药典》中牛膝的含量测定以β-蜕皮甾酮为质量评价依据,其在Inertsil ODS-3中的色谱特点为:在流动相组成为乙腈-水-甲酸系统时,流动相的比例对β-蜕皮甾酮的分离具有显著的影响,流动相水的比例在82%、乙腈的比例在18%左右时,其分离度最好,选择水比例在80-84%(v/v)之间均可以获得较好的分析效果;柱温对β-蜕皮甾酮的分离度影响较大,升高柱温可提高β-蜕皮甾酮与相邻色谱峰的分离度,因此选择柱温为45℃;流动相pH值对牛膝的β-蜕皮甾酮峰型、β-蜕皮甾酮与相邻色谱峰的分离度影响不大。推荐流动相配比范围:乙腈:水:甲酸=(16-20):(84-80):(0.01-0.5)。经过考察,在流动相乙腈-水-甲酸比例为18:82:0.1,柱温45℃的色谱条件下能得到较满意的分析效果。
  在上述色谱条件下,采用Shim-pack VP-ODS色谱柱分析牛膝药材,表现出和Inertsil ODS-3色谱柱相似的色谱行为,保留时间和柱效相当。
样品来源: 本品为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata B1. 的干燥根。
对照品: β-蜕皮甾酮(成都曼思特生物科技有限公司,批号:MUST-15071108,含量:99.99%)
对照品溶液的制备: 取β-蜕皮甾酮对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备: 取本品粉末(过三号筛)约l g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水饱和正丁醇30mL,密塞,浸泡过夜,超声处理(功率300W,频率40kHz)30分钟,滤过,用甲醇10mL分数次洗涤容器及残渣,合并滤液和洗液,蒸干,残渣加甲醇使溶解,转移至5 mL 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。

推荐使用色谱条件:   仪器配置:
色谱柱: Inertsil ODS-3 (4.6×250mm,5μm )   LC-20AD 高压泵
流动相: 乙腈-水-甲酸(18 : 82 : 0.1)   SPD-20AV二极管阵列紫外可见光检测器
柱温: 45℃   DGU-20A5 脱气机
检测波长: 250nm   CTO-20AC柱温箱
流速: 1.0mL/min   SIL-20AC自动进样器
进样量: 10μL    
*此条件同样适用于Shim-pack VP-ODS(4.6×250 mm, 5 μm)色谱柱,相关谱图见附注1。

■β-蜕皮甾酮对照品溶液:

■供试品溶液:

■β-蜕皮甾酮标准曲线:

■β-蜕皮甾酮的重复性:

序号 对照品(10μL) 样品(10μL)
t/min 峰面积 t/min 峰面积
1 15.13 1934445 15.14 2181092
2 15.11 1958315 15.12 2181737
3 15.09 1948012 15.15 2181536
平均值 15.18 1961911 15.14 2181455
RSD/% 0.13 0.61 0.10 0.02

附注1:Shim-pack VP-ODS (4.6×250 mm,5 μm )色谱柱用于牛膝分析

流动相:乙腈-水-甲酸(18 : 82 : 0.1)
柱温:45℃
检测波长:280nm
流速:1.0mL/min
进样量:10μL

■β-蜕皮甾酮对照品溶液:

■牛膝供试品溶液:

* 实验数据由北京大学医学部陈世忠教授课题组提供