盐酸帕罗西汀及相关物质检测

【含量测定】高效液相色谱法测定

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6 mm 250 mm,5m或效能相当的色谱柱);取醋酸铵3.96g,加水720ml使溶解,加乙腈280ml、三乙胺10ml,用冰醋酸调节pH值至5.5为流动相;检测波长为295nm。分别取盐酸帕罗西汀、杂质I与杂质II对照品各5mg,置同一10ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为系统适用性溶液,取20μl注入液相色谱仪,记录色谱图,出峰顺序依次为杂质I、帕罗西汀与杂质II,理论塔板数按帕罗西汀峰计算不低于3000,帕罗西汀峰、杂质I峰与杂质II峰之间的分离度均应大于2.5。

样品溶液的制备 分别取盐酸帕罗西汀、杂质I与杂质II对照品各5mg,置同一10ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为系统适用性溶液,取20μl注入液相色谱仪。

测定法 精密量取样品溶液20 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图及相关色谱信息,即得。


1. 实验部分

1.1 实验仪器及耗材

Shimadzu LC-2030高效液相色谱仪;
色谱柱InertsilSustain C18 (4.6×250 mm,5 μm;C/N 5020-07346)
盐酸帕罗西汀,杂质I(去氟帕罗西汀)、杂质II(N-甲基帕罗西汀)

1.2 分析条件

色谱柱: InertlSustain AQ-C18 (4.6×250 mm,5 μm )
流动相: 醋酸铵3.96g,加水720ml使溶解,加乙腈280ml、三乙胺10ml,用冰醋酸调节pH值至5.5为流动相
柱温: 25℃
检测波长: 295 nm
流速: 1.0 mL/min
进样量: 20 μL

1.3 样品溶液的制备

样品溶液的制备 分别取盐酸帕罗西汀、杂质I与杂质II对照品各5mg,置同一10ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为系统适用性溶液,取20μl注入液相色谱仪

2. 结果及讨论

2.1 液相色谱条件的选定

  在检测的过程中,采用国家药典标准的检测条件,使用InertSustain AQ-C18对样品进行分析:
  以InertSustain AQ-C18为色谱柱;以醋酸铵3.96g,加水720ml使溶解,加乙腈280ml、三乙胺10ml,用冰醋酸调节pH值至5.5为流动相;流速为1.0 mL/min;柱温为25℃;检测波长为295nm。取样品溶液20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。

化合物 保留时间 面积 高度 理论塔板数 分离度 拖尾因子
杂质I 28.752 7283878 176505 10160 34.019 1.917
盐酸帕罗西汀 35.823 7052295 140769 10713 5.604 1.901
杂质II 39.804 7334387 125052 9595 2.645 2.113

  药典方法下InertSustain AQ-C18色谱柱能够对盐酸帕罗西汀及相关物质达到很好的分离,其中主峰与杂质I的分离度达5.604,主峰与杂质II的分离度达2.645,均大于药典要求的2.5,满足日常分析需求。但杂质II色谱峰拖尾因子较大,并且随着保留时间的延长,色谱峰的拖尾因子也越大,其原因可能是进样量太大,超出了柱子的载样量,所以接下来将尝试减少进样量。

  以InertSustain AQ-C18为色谱柱;以醋酸铵3.96g,加水720ml使溶解,加乙腈280ml、三乙胺10ml,用冰醋酸调节pH值至5.5为流动相;流速为1.0 mL/min;柱温为25℃;检测波长为295nm。取样品溶液10μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。

化合物 保留时间 面积 高度 理论塔板数 分离度 拖尾因子
杂质I 29.117 3626972 97415 13482 39.106 1.482
盐酸帕罗西汀 36.292 3515100 77044 13967 6.434 1.466
杂质II 40.318 3654420 69846 13074 3.051 1.586

  通过减少进样量,InertSustain AQ-C18色谱柱对盐酸帕罗西汀及相关物质有很好的分离效果,其中主峰与相邻杂质峰的分离度分别可以达到6.434和3.051,大于药典要求的2.5,满足日常分析需求。同时,进样量减少了,峰型有所改善,拖尾因子也相应的减少了,各色谱峰的拖尾因子分别为杂质I:1.482,盐酸帕罗西汀:1.466:杂质II:1.586。接下来继续减少进样量

  以InertSustain AQ-C18为色谱柱;以醋酸铵3.96g,加水720ml使溶解,加乙腈280ml、三乙胺10ml,用冰醋酸调节pH值至5.5为流动相;流速为1.0 mL/min;柱温为25℃;检测波长为295nm。取样品溶液5μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。

化合物 保留时间 面积 高度 理论塔板数 分离度 拖尾因子
杂质I 29.189 1808590 51263 15370 40.765 1.255
盐酸帕罗西汀 36.379 1754647 40308 15725 6.841 1.246
杂质II 40.421 1824610 37071 15203 3.270 1.314

  减少进样量,对主峰与杂质峰的分离度没有太大影响,均大于2.5,满足日常分析需求。通过进一步减少进样量,色谱峰型得到了进一步的改善,拖尾因子也相应的减少了,各色谱峰的拖尾因子分别为杂质I:1.255,盐酸帕罗西汀:1.246:杂质II:1.314。接下来继续减少进样量。

  以InertSustain AQ-C18为色谱柱;以醋酸铵3.96g,加水720ml使溶解,加乙腈280ml、三乙胺10ml,用冰醋酸调节pH值至5.5为流动相;流速为1.0 mL/min;柱温为25℃;检测波长为295nm。取样品溶液3μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。

化合物 保留时间 面积 高度 理论塔板数 分离度 拖尾因子
杂质I 29.440 1071469 30514 15849 35.385 1.168
盐酸帕罗西汀 36.710 1036117 23905 16118 6.950 1.164
杂质II 40.807 1078534 22118 15878 3.342 1.208

  通过减少进样量,InertSustain AQ-C18色谱柱对盐酸帕罗西汀及相关物质有很好的分离效果,其中主峰与相邻杂质峰的分离度分别可以达到6.950和3.342,大于药典要求的2.5,满足日常分析需求。同时,进样量减少到了3μl,峰型有了大幅改善,各色谱峰的拖尾因子分别为杂质I:1.168,盐酸帕罗西汀:1.164:杂质II:1.208。不能再接着减少进样量了,若进样量低于3μl,会影响进样准确性。

  接下来,采用国家药典标准的检测条件,使用Inertsil ODS-3对样品进行分析:
  以Inertsil ODS-3为色谱柱;以醋酸铵3.96g,加水720ml使溶解,加乙腈280ml、三乙胺10ml,用冰醋酸调节pH值至5.5为流动相;流速为1.0 mL/min;柱温为25℃;检测波长为295nm。取样品溶液3μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。

化合物 保留时间 面积 高度 理论塔板数 分离度 拖尾因子
杂质I 26.303 1066061 31448 13560 34.341 1.139
盐酸帕罗西汀 33.103 1033773 24527 13908 6.712 1.136
杂质II 37.694 1078193 22222 13599 3.801 1.254

  药典方法下Inertsil ODS-3色谱柱能够对盐酸帕罗西汀及相关物质达到很好的分离,其中主峰与杂质I的分离度达6.712,主峰与杂质II的分离度达3.801,均大于药典要求的2.5,满足日常分析需求。同时,与InertSustain AQ-C18色谱柱的分析结果进行比较,样品中的三个物质的保留时间均减少了3min左右,在保证分离度的前提下缩短了分析时间。同样的,进样量减少到了3μl,各色谱峰的拖尾因子分别为杂质I:1.139,盐酸帕罗西汀:1.136:杂质II:1.254。

3. 结论

  本实验采用岛津技迩公司的InertSustain AQ-C18 (4.6×250 mm,5 μm )和 Inertsil ODS-3 (4.6×250 mm,5 μm )色谱柱进行盐酸帕罗西汀及相关物质检测实验。以醋酸铵3.96g,加水720ml使溶解,加乙腈280ml、三乙胺10ml,用冰醋酸调节pH值至5.5为流动相的条件下,柱温25℃条件下,整个分析过程在45min内结束,盐酸帕罗西汀与杂质I和杂质II能够得到很好的分离,且理论塔板数在10000以上。但进样量为20μl时,色谱峰出现比较严重的拖尾现象,当进样量降低到3μl或5μl时,峰型大幅改善,进样量大造成拖尾现象一般有两种情况,一是进样量超载,一种是流动相缓冲容量较小,根据本研究流动相的组成,我们认为流动相的缓冲容量是比较大的,因此推测为InertSustain AQ-C18的载样量比较小所致,这在其他样品的分析中也曾出现过,因此建议在推广InertSustain AQ-C18色谱柱时,应跟客户说明该柱的特点,以免造成不良影响。同时,我们也采用Inertsil ODS-3色谱柱对样品进行了分析,相较InertSustain AQ-C18色谱柱来说,Inertsil ODS-3色谱柱同样满足要求,且可缩短分析时间,适用于盐酸帕罗西汀及其相关物质的日常质量检测。