探索寡核苷酸杂质分离|Shim-pack Scepter Claris液相色谱柱
2024年8月16日
具有治疗潜力的核酸和mRNA疫苗在制药工业成为新的增长点。其中寡核苷酸发展迅猛,寡核苷酸是由20到60个碱基组成的单链或双链核酸片段。包括反义寡核苷酸(ASOs)、小干扰RNA (siRNA)、microRNA以及适配体。在生物化学、分子生物学和遗传学中有着广泛的应用。
寡核苷酸由于细胞外稳定性低,溶剂被核酸酶解,同时难以进入细胞等因素的影响发展缓慢,近些年,由于核酸修饰(磷酸骨架,碱基以及糖环的修饰)以及递送介质(脂质体等)等相关技术的突破,使其成为继小分子药物、抗体蛋白质药物之后,出现的一类新模式药物,是近年药物开发的热点之一。
寡核苷酸的结构决定了它极性非常强,在常规的反相色谱柱上很难保留,可以使用HILIC模式、离子交换模式或者借助于离了对试剂在反相柱上实现保留,不同分离模式各自有自己的局限性。IP-RP作为其中最常用的一种,应用范围最广,今天我们从方法开发的角度一探究竟。
Part 1 方法初筛
不同离子对试剂的选择对于物质的保留差异较大。此次分析的样品是20个碱基的寡核苷酸,优先选择TEA作为离子对试剂,后期因为涉及进质谱进行质量确认,所以加入了100mmol的HFIP增加灵敏度。采用不同比例的有机相、结合不同浓度的缓冲盐浓度,优化色谱方法,得到24张色谱图,叠加如下文图1所示。
系统: Nexera XS inert
色谱柱: Shim-pack Scepter Claris C18(100 mm x2.1 mm l.D.,3 um,P/N:227-31210-05)
温度: 60°C
进样量:2 μL
流速: 0.4 mL/min
泵A
-Line A: 100 mmol/L HFlP and 20 mmol/LTEA水溶液
- Line B:100 mmol/L HFIP水溶液
-Line C: 200 mmol/L HFlP and 20 mmol/LTEA水溶液- Line D: 200 mmol/L HFIP水溶液
泵B
- Line A: 乙腈
- Line B: 甲醇
时间程序(%B):6%(0 min)>24 %(36 min)>50 %(36-37 min)>6%(37-46 min)
检测器:260 nm(SPD-M40,UHPLC惰性流通池)
质谱系统:LCMS-2050
离子源: ESI/APCI(DUISTM),负模式
扫描模式: SCAN(m/z 500-2000)
雾化器: 2.0 L/min(N2)
干燥气: 5.0 L/min(N2)加热气:7.0 L/min(N2)
DL温度:200°C
温度: 450°C
电压:-2.0 kV
整体色谱柱峰形优异,惰性化柱管对于因柱管导致的峰形拖尾等问题,改善明显。
从②⑤⑧可以看出,随着离子对试剂浓度的增加,保留提升,分离得到进一步的改善。
HFIP浓度以及有机相的比例会影响基线,200mmol/L的HFIP中有100%纯乙腈流动相会引起基线的抬升,比如⑬, ⑯, ⑲和㉒的实验结果。对比结果⑧和结果⑳,可以看出HFIP的提升,对于分离展现出不同的效果。此外,在一些文章中也提到需要在流动相中加入一定比例的HFIP,这样使得TEA的溶解度变小, 因而TEA更容易绑缚在固定相上形成更稳定的离子对试剂层 。这促使离子相互作用的分离机制非常显著,尤其针对于硫代寡核苷酸。
从②③的实验结果可以看出,不同的有机试剂含量对于杂质分离展现不同的选择性。不同流动相HFIP和TEA中的浓度、以及有机溶剂乙腈与甲醇的混合比例对FLP和FLP相关杂质分离影响较大。
最终,通过矩阵设计,考察分离效果,结果表明实验条件⑤的分离效果最佳,采用的流动相条件为:100mM HFIP 10mM TEA/ACN 50%_MeOH 50%。
Part 2 方法优化
参考以上分离结果,进一步优化有机相混合比例、柱温以及梯度条件。
发现40%甲醇-60%乙腈混合比例对于寡核苷酸的分离效果更优。
文献中提到升高的柱温通常减小峰宽,从而一定程度上改善了杂质分离,因此也是主要的一个影响因素。Scepter Claris C18色谱柱采用杂化硅胶,不仅具有杂化硅胶可以耐受高柱温的特性,而且Scepter Claris色谱柱采用生物惰性涂层,相比于其他柱管的惰性化程度,惰性更优,峰形改善更明显。所以,进一步优化如图3所示,柱温65℃的峰展宽更弱,峰形更窄。
最后考察了洗脱的梯度,优化梯度条件,确定最优的梯度检测条件。
最终确定了检测条件如图5所示,从图中可以发现实现从不同角度优化方法,实现了n-1、PO等杂质的良好分离。
同时,在寡核苷酸的分析检测中,除了C18色谱柱应用较多,C4色谱柱由于区别于C18的选择性,应用也非常多,常见于生物分析等。
采用岛津Nexera XS inert 系统,配套岛津全新卓越惰性杂化硅胶色谱柱——Shim-pack Scepter Claris C18,从流动相比例、梯度、柱温等方面优化方法,避免了不锈钢柱管吸附导致的峰形问题,有效实现寡核苷酸的分离分析。结合LabSolutions MD可实现整个工作流程优化自动化,包括生成分析进度表、如自动峰值跟踪具体的数据处理功能、色谱的评价值和设计空间等,有效提升方法开发的效率。